上一篇《关于美白那些事儿》推文中讲到，皮肤变黑的影响因素有很多，为达到美白效果，我们可以通过不同的生物化学通路抑制或调节黑色素的生成、转运和代谢，如抑制酪氨酸酶活性、干扰黑色素合成、阻断黑色素转运、加速黑色素分解以及抗氧化和抗炎作用等。那么接下来，就让我们一起来看看依据不同抑制途径构建的体外细胞培养模型及祛斑美白功效评估方式吧！

1.酪氨酸酶活性抑制实验

酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，它催化酪氨酸转化为黑色素的前体。抑制这一酶的活性可直接减少黑色素产生。采用生化反应法可测定酪氨酸酶活性抑制率。

图1 酪氨酸酶活性抑制率

随着样品浓度的升高，酪氨酸酶活抑制率逐渐上升，样品具有良好的美白祛斑功效。

参考标准：T/SHRH 015-2018化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验方法

2.酪氨酸酶活性和黑素含量测定（B16-F10）

图2 酪氨酸酶活性抑制率 图3 黑素含量

样品组酪氨酸酶活力显著下降，黑素含量减少，表明样品具有良好的美白祛斑功效。

黑素细胞体外培养实验

小鼠B16黑色素瘤细胞和人A375黑色素瘤细胞模型通常被用于实验。小鼠B16细胞因能够多次传代、生长速度快和对培养条件要求相对较低等特点，成为美白功效评估的优选细胞。但该细胞与人体内的黑素细胞仍存在一定差异，且多次传代后产黑素能力下降。通常需采取重新引种、体内成瘤再培养、优化培养条件、基因工程技术转染表达黑素合成关键酶的基因等方式恢复其高表达状态。因此，B16细胞常用于初步或高通量筛选，但在最终应用于人类前，还需通过人类细胞或临床数据验证。

A375细胞来自于人类黑色素瘤，其生物学特性和变化更能反映人类细胞的实际响应，对研究黑色素生成和美白成分的功效具有重要意义；疾病相关性更高，使用这些细胞进行的研究更具临床相关性，尤其在探索可能的治疗方法或美白机制方面；使用人类细胞可以更准确地评估药物的效果和安全性，更好地模拟药物在人体内的作用。但A375细胞的培养条件更苛刻，成本较高，实验操作更复杂。

图4 体外正常培养的B16黑色素瘤细胞和A375黑色素瘤细胞（A: B16F10; B: A375）

3.黑色素瘤细胞基因表达测定（B16-F10）

图5 黑色素瘤细胞基因表达测定

样品组黑素细胞相关基因表达下调，表明样品具有良好的美白祛斑功效。

4.黑色素瘤细胞树突长度和数量测定（MNT-1）

黑色素细胞树突数量增加，树突长度变长，会促进黑色素向角质形成细胞的转移，如果测试物对这种情况有抑制，则树突数量会减少且长度变短。

图6 黑色素瘤细胞树突长度和数量测定

随着浓度的增加，黑素细胞树突数量减少长度变短，样品具有良好的美白祛斑功效。

黑素细胞与角质形成细胞共培养实验

黑素传递是皮肤中黑色素细胞（Melanocytes，MC）与角质形成细胞（Keratinocytes，KC）之间的一个关键过程，它涉及黑素从MC转移到KC，以保护皮肤免受紫外线（UV）辐射的伤害。首先，黑素细胞在其黑素体（一种特化细胞器）中合成黑素，此过程主要受到酪氨酸酶（Tyrosinase）和其他相关酶的催化；黑素合成后，黑素体会在黑素细胞内成熟并被运输到细胞末梢（依赖于细胞骨架的动力学和相关运输蛋白）；随后，黑素细胞与角质形成细胞通过其突起（或称黑素细胞突触）形成物理接触。黑素体通过这些突起被运送到与角质形成细胞的接触点，通过“细胞吞噬”（Cytocytosis）过程释放到角质形成细胞。角质形成细胞通过一种类似于吞噬的机制（可能涉及内吞作用）接收黑素体。一旦进入角质形成细胞，黑素体被运输到细胞核周围，形成保护屏障，帮助屏蔽DNA免受紫外线引起的损伤。

在人体内部，一个黑色素细胞（MC）能够与10至36个角质形成细胞（KC）建立联系，并向它们传递黑素。在实验室条件下，通过调整两种细胞的培养比例，将永生化人表皮角质形成细胞系HaCaT与人类黑色素瘤细胞MNT-1共培养构建体外“表皮黑素单元”模型，可用于研究黑素细胞与角质形成细胞的交互作用，评估产品美白效果。

图7 体外正常培养的HaCaT细胞和MNT-1黑色素瘤细胞（A: HaCaT; B: MNT-1）

5.黑色素转移测定（HaCaT- MNT-1共培养，IF）

图8 荧光染色黑素转移测定

样品组红色荧光强度下降，表明黑色素转移受到抑制，样品具有良好的美白祛斑功效。

6.黑色素转移测定（HaCaT-黑素小体共培养）

在体外评估美白产品的功效时，使用黑素小体（melanosomes）和角质形成细胞共培养的方法是可行的。黑素小体是黑色素细胞产生的细胞器，主要负责储存和转运黑色素。通过将这些黑素小体直接与角质形成细胞共培养，可以模拟黑素从黑色素细胞到角质形成细胞的转移过程，直接评估美白成分对黑素小体的影响，如抑制黑素的吞噬或影响其在角质形成细胞中的分布和稳定。

但黑色素细胞不仅仅是黑素的生产单位，它们还参与许多调控过程，如黑素的合成、成熟、分泌等。仅使用黑素小体可能无法完全复制这些复杂的生物学过程。黑素小体需要从黑色素细胞中提取，这一过程复杂且难以标准化，黑素小体的质量和活性可能因提取方法而异。

图9 黑素转移显微镜图

给予黑色素粗提物后细胞中明显可见黑色素的存在，并分布于细胞核周围，形成“核上帽”，增加裂解的黑色素细胞数量可以获得更多黑色素体，并使角质形成细胞中黑色素量增加，转移实验结果更显著。

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