化妆品的刺激性是消费者们在购买产品时最为关注的方面之一，毕竟大家都希望在使用化妆品后能改善皮肤状态而不是“烂脸”。

我国的法规对这一方面也十分重视，《化妆品安全技术规范（2015版）》中“毒理学试验方法”部分对化妆品原料及其产品安全性评价的毒理学检测做出规定，要求化妆品新原料需进行刺激性实验。刺激性实验包括皮肤和急性眼刺激性/腐蚀性实验，《规范》中所规定的两种实验均为在体动物实验。

但近年来，以欧盟为首的全球众多国家和地区正呼吁禁止在化妆品安全评价中使用动物实验，这使得开发替代动物实验的体外化妆品刺激性评价方法成为未来的趋势。目前，欧洲替代方法验证中心（ECVAM, European Centre for the Validation of Alternative Methods）已经验证了多种满足动物实验3R原则的化妆品体外皮肤/眼球刺激性的评价方法。

眼球刺激性/腐蚀性评价

1 牛角膜透明度和透气性试验（BCOP）

BCOP法是利用离体牛角膜与受试物直接接触，若受试物具有刺激性则会导致牛角膜上皮屏障功能破损和基质蛋白变性。

该方法将牛角膜的透明度和透气性作为毒理学的评价指标，根据公式计算与两个指标数值相关的体外刺激分数（In Vitro Irritancy Score，IVIS），通过评分进行分类：若IVIS > 55，则受试物具有严重眼刺激性；若IVIS ≤ 3，则无刺激性；若3＜IVIS ≤ 55，则无法判断，需结合其他替代方法进一步测试。

BCOP法可用于分辨眼刺激性的有无，但无法准确区分轻微、中等刺激，且无法区分严重眼刺激与眼损伤，该方法不受样品剂型、溶解性的限制。

2 离体鸡眼试验（ICE）

ICE法是利用短期离体培养的鸡眼球进行眼刺激性试验的方法。

取鸡眼球固定于夹持器，暴露受试物，通过肉眼检查、测量角膜厚度、表面灌流和荧光素渗透，将角膜浑浊度、角膜膨胀度和荧光素滞留度的数值作为评价指标，分别对三个评价维度进行ICE分类，每个维度包括I、II、III、IV四个等级，最后通过三个评价指标的终点组合分析：若终点组合为3×I或2×I+1×II，则无刺激性；若终点组合为3×IV、2×IV+1×Ⅲ、2×IV+1×II、2×IV+1×IV、30 min时角膜浑浊度≥3（至少两只眼球）、任何时间点角膜浑浊度= 4（至少2只眼球）、上皮严重松弛（至少1只眼球），则有严重眼损伤和眼腐蚀；若为其他情况，则无法判断。

ICE法可用于鉴别化学物的眼腐蚀和严重眼损伤或无刺激性，但无法区分严重眼刺激、眼损伤。该方法适用于固体、液体、乳剂、凝胶状化合物。

3 短期暴露试验（STE）

STE法利用兔眼角膜细胞（SIRC），将受试物短期暴露5min，使用MTT法或CCK-8法测定细胞吸光度，通过计算受试物暴露后引起角膜上皮的细胞生存率判断受试物的眼刺激性。

若受试物5%和0.05%质量比浓度引起细胞生存率≤70%，则该受试物有刺激性；反之，若受试物5%和0.05%质量比浓度引起细胞生存率＞70%，则无眼刺激性。

4 重组人角膜上皮模型试验（RhCE）

RhCE模型是将来源于正常人的表皮角质细胞生长于特殊制备的嵌入式细胞培养板中，通过培养，细胞分化形成多层结构，从而构建与角膜上皮非常相似的三维模型，目前 EpiOcularTMEIT是唯一已获得OECD指南验证的标准模型。

受试物暴露于类似角膜上皮模型一定时间后，使用MTT法计算细胞吸光度，通过计算受试物暴露后引起角膜上皮的细胞生存率判断受试物的眼刺激性。若细胞存活率＞60%，则无刺激；若存活率≤ 60%，代表有刺激，但无法区分严重眼损伤或眼刺激，也无法对眼刺激进一步分类，此时需要使用其他方法进一步判断。

5 鸡胚绒毛-尿囊膜试验（HET-CAM）

9日龄鸡胚（CAM）开始试验。用牙科弯镊小心剥去气室蛋壳部分，在蛋壳膜表面滴几滴生理盐水使充分润湿，倾出后，用镊子小心除去蛋壳膜，保证暴露的尿素膜完整不受任何损伤。取0.3mL/0.3g受试物直接作用于CAM。尽量涂布开，确保覆盖面积达到至少50%。作用3min后，用纯水轻轻冲洗CAM表面，在30s内冲洗完成，倾出液体，立即在体视镜下观察每种毒性效应变化程度，给予评分（ES）。

若ES≤12，则评价为无眼刺激性或轻度眼刺激性；若12＜ES＜16，则评价为中度眼刺激性；若ES≥16，则评价为严重眼刺激性。

该方法适用于多种类型液体原料和产品，对固体、不溶性、黏稠性物质的重复性差，慎用于色素和染料的测试，主要适用于无刺激到轻度刺激物的预测。

皮肤刺激性/腐蚀性评价

1 重组人表皮模型试验（RHE）

RHE试验是通过培养未分化的人体表皮角质形成细胞，重组三维人体表皮的模型。

常见的皮肤刺激性评价模型有EpiSkin、EpiDermTM、SkinEthicTM、LabCyte EPI-MODEL24 SIT；皮肤腐蚀性评价模型有EpiskinTM、EpiDermTMSCT、SkinEthinTMRHE和epiCS。

该方法将受试物直接与模型接触一定的时间后，使用MTT法测试细胞毒性，不同的模型有其相应的判断指标。

下面对其中一种皮肤腐蚀性的EpiskinTM模型进行介绍。该模型主要通过细胞存活率进行判断：当受试物暴露3min 后，若细胞存活率<35%，则有腐蚀性，腐蚀性强度为1A；若暴露3 min后，存活率≥35%且暴露60 min后，存活率＜35%，则有腐蚀性，腐蚀性强度为1B和1C；若暴露240min后，存活率≥35%，则无腐蚀性。该方法不仅可用于鉴别物质是否具有腐蚀性，且可以对腐蚀性强度 1A、1B和1C 进一步分类，但无法区分1B、1C。受试物可以为固态、半固态、液体和蜡状。

2 体外经皮电阻试验（TER）

将待测的化学物质暴露于离体的大鼠皮肤表面，具有腐蚀性的受试物可破坏表皮角质层，使通过皮片的电阻值（TER）明显降低。若经皮电阻值＞5 kΩ，则受试物无腐蚀性；若经皮电阻≤5 kΩ，而且该受试物不是表面活性物质或中性有机溶剂，评定受试物具有腐蚀性；如果受试物为表面活性物质或中性有机溶剂，经皮电阻≤5 kΩ，可增加硫丹明B染色剂穿透试验，以确定是否出现假阳性。

TER试验与人体皮肤模型试验相比具有简便、经济和对试验条件要求不苛刻的优点。

最后，用表格对上述知识点再进行一次总结，要多多复习。